RP-HPLC是制药及相关行业中应用最广泛的质量控制的工具。为了达到在一次运行中同时分析极性差异比较大的化合物等目的，很多分析人员会选择设计梯度方法。然而，梯度HPLC有时会被看似随机和不可控的“鬼峰（ghost peak）”问题所困扰，尤其是在使用的试剂的质量不是很高时。当梯度HPLC色谱图中突然出现鬼峰而无法排查和消除时，可能就必须放弃这个梯度方法。因此，在方法开发时系统了解鬼峰的来龙去脉以及如何应对非常重要。
“鬼峰”在文献中也有很多其他称呼，比如人造峰（artifact peaks）、系统峰（system peaks）、伪峰（pseudo peaks）、空位峰（vacancy peaks）、本征峰（eigenpeaks）、诱导峰（induced peaks）和伪峰（spurious peaks），而“鬼峰（ghost peaks）”最常被使用。鬼峰虽然看上去“神出鬼没”，但是可以通过了解其形成机理而进行针对性的排查，进而采取合适的应对方法。接下来我们将以鬼峰的来源分类展开。
1. 鬼峰的最大来源：被污染的流动相
1.1 鬼峰形成的机理
HPLC图谱不仅反映的是样品的状况，也反映流动相和仪器系统的状况，而流动相中存在的某些污染物是鬼峰最常见的来源。流动相中的这些污染物在等度方法中往往不会以“峰”的形式出现，但是在梯度方法中却常常形成鬼峰，这是因为梯度方法中随着洗脱能力的增强，对这些污染物在色谱柱上的色谱带产生压缩，且当梯度斜率越大时，压缩效应越明显。如下图所示：
这样，在色谱柱上发生了类似固相萃取（SPE）一样的富集效应，让原本微量的污染物汇聚成峰。比如流动相中的一个约1 ng/mL的塑化剂DOP（邻苯二甲酸二辛酯）也在梯度方法中形成了一个明显的鬼峰（如图2）。
1.2 水中的杂质
用于梯度HPLC的水必须尽可能纯净新鲜， 它最好不含有机物、无机离子和不溶性颗粒等。一般商业化的分析实验室用的纯水仪都能净化出符合要求的水，这些仪器一般包含多种净化过程，比如活性炭吸附（将水中的氯含量降低至μg/mL以下）、微孔过滤（如5 μm）（滤除颗粒物）、反渗透（去除大部分的无机离子）、紫外光氧化（灭菌及氧化分解有机物）、离子交换（进一步降低无机离子含量）、炭材料吸附（进一步降低有机物含量）、超微过滤（如0.05 μm）；而商品化的纯化水一般也是经过类似的处理过程或者采取蒸馏的方式进行净化处理。水处理装置中有些部件需要及时清洗消毒或者更换，以免纯化的水不能达到要求。
水中最常见的污染来自于微生物的污染。水相的滤吸头如果没有注意及时更换或者清洗，那么这种高比表面的多孔部件将成为微生物的“避风港”，即使换上新鲜的水相，也会因为其繁殖而产生各种代谢的有机物，当这些物质进入色谱体系就可能成为鬼峰。在各种微生物中，最主要的是革兰氏阴性菌（如假单胞菌属），它们可以在纯水中生存和繁殖，当水中存在如磷酸盐或者乙酸盐时生命活动更加旺盛。在20-35℃时，它们可以迅速繁殖，只需几天就可以在HPLC中检测到它们的存在，而且有研究表明即使pH到9都无法抑制它们的繁殖。冷藏流动相是抑菌的有效手段，但是很多情况这种操作并不现实。微生物家的建议是在水相中至少添加15%的甲醇来抑菌，也有建议至少添加5%的乙腈来达到类似的效果，也有人建议在水相中添加叠氮化钠来抑菌，但是由于这种试剂剧毒、易爆且不易购买而在国内少有采用。另外，水相的溶剂瓶也应该经常用有机溶剂清洗并充分干燥，而不是只是简单用水清洗后接着用。除此之外，有些仪器上配置的泵头密封垫清洗装置（seal-wash）中的清洗液如果没有考虑到抑菌操作（如经常更换或者加入有机相）也会引入微生物污染。
另外还有一个需要特别注意的事项，那就是千万不要（注意：不是尽量避免）使用洗瓶来补充用于HPLC流动相的水，因为来自洗瓶中的水不仅含有从洗瓶塑料中溶解出来的有机物（如塑化剂），而且往往含有不少的微生物及其代谢物！
1.3 有机溶剂中的杂质
甲醇（MeOH）：在现代工业中甲醇一般是通过氢气和一氧化碳通过催化反应而获得，由于反应简单，因此商业化的甲醇一般很少有杂质，HPLC梯度级甲醇的纯度一般比同级别的乙腈高。然而由于甲醇在190-260 nm的吸收比乙腈强，因此使用甲醇时的梯度方法的基线漂移一般比乙腈更明显。当甲醇中存在某些杂质，不管是在生产过程还是在灌装、储存过程中引入，都可能会让使用到该甲醇的梯度HPLC方法中出现鬼峰，如图4所示：
乙腈（ACN）：乙腈一般是作为工业化生产丙烯氰的副产物而被制造出来。乙腈中的杂质范围相当大，而且从装瓶到色谱分析实验室之前可能会经历多个处理过程。乙腈中已经被发现的杂质包括乙酰胺、乙烯亚胺、甲胺、乙胺、苯、烯丙醇、丙烯腈、HCN、丙烯醛、噁唑、甲基丙烯腈、丁二腈、戊二腈、二叔丁基甲基苯酚、丁基化羟基甲苯、戊二腈、琥珀腈和氨等。考虑到其中一些杂质和乙腈具有相似的化学性质和沸点，因此将乙腈纯化到HPLC梯度级别的难度就大很多。因此，市面上可供选择的乙腈可能的等级就非常多。我们可以通过检查其紫外光谱来评估乙腈的纯度，也可以用空白梯度色谱图对乙腈的纯度进行更准确和实用的评估。
四氢呋喃（THF）：四氢呋喃是一种非常有用的反相有机溶剂，但是由于其截止波长比较高（212 nm），一般不单独使用。当在甲醇或者乙腈的体系中添加一定量（1-10%）的四氢呋喃时，可能就可以获得很不一样的选择性，从而改善分离或者峰形。由于四氢呋喃这种醚类溶剂会与空气中的氧气反应生成危险的过氧化物，因此很多供应商会在其中加入稳定剂（如BHT，即2, 6-二叔丁基对甲苯酚），当存在这种稳定剂时，可能在梯度中间就会出现相应的鬼峰。市面上也有不含这种稳定剂的四氢呋喃供应，但是需要注意储存和使用过程中减少与空气接触。
1.4 流动相添加剂的杂质
当梯度色谱中含有鬼峰，如果水和有机溶剂的纯度较高，那么任何流动相添加剂就是下一个可疑的鬼峰来源。流动相越复杂，杂质和鬼峰出现的几率越大。如果怀疑是某种添加剂的问题，可以配制除了不加这种添加剂外其他都一致的流动相来做对比，进而确定鬼峰的来源。 市面上的磷酸盐和醋酸盐的纯度差异比较大，有些不适合用于梯度HPLC方法，因此订购的时候需要甄别；三氟乙酸也会随着时间的推移而纯度下降，比如放置时间比较久的三氟乙酸经常呈现淡褐色。图5可以看到在该梯度方法中，使用99%纯度的TFA在13.5 min左右出现了使用光谱级TFA没有的鬼峰。
1.5 邻苯二甲酸酯，塑料中的添加剂和空气中的有机物
梯度 HPLC 的洗脱液绝不能存放在塑料容器中。因为塑料可能含有软化剂、抗氧化剂、稳定剂或着色剂，它们可能会从材料中渗出并导致鬼峰问题。对于梯度HPLC方法，需要避免接触的塑料制品也应扩展到量筒、移液管和洗瓶等。 甚至有人发现当pH计探头插入水性缓冲溶液时会发生鬼峰污染，因此建议在调节pH值时最好取一小份来测量 pH 值，而不是直接将 pH 计探头插入溶液中。
邻苯二甲酸酯是半挥发性液体，常用作树脂和聚合物的增塑剂。在 PVC 中，它们的含量可能超过 60% (w/w) 。自 1940 年代以来，邻苯二甲酸盐的产量每年达到数百万吨，现在广泛分布在世界各地，几乎可以在所有地表甚至在北极圈内检测到，浓度范围为 0.1~20 ng/m3。已在多种实验室材料内部和表面检测到它的存在，包括蒸馏水、溶剂、实验室空气、玻璃器皿、瓶盖、二氧化硅、氧化铝、滤纸、铝箔、硅藻土、硫酸钠、氯化钠和碳酸钙等试剂和离子交换材料等。其中空气中的 DEHP（邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯）浓度可能高达 35 ng/m3，具体取决于建筑物中使用的材料。即使在干净的玻璃表面上，邻苯二甲酸盐的含量也会随着时间的推移通过空气吸附而增加，因此可以推断暴露在空气中的洁净的溶剂的对这些物质的吸收也会随着时间的推移而增加。已知存在于室内空气中的其他有机化合物包括表面活性剂、阻燃剂、抗氧化剂和除臭剂等。同样，在 HPLC 实验室中不应过度使用洗洁精和挥发性清洁产品（最好完全不使用），因为这些都可能成为鬼峰的源头。
1.6 流动相的玻璃容器的污染
玻璃应该是最适合用于制作HPLC流动相容器的材料，但是未经处理的玻璃的表面活性较高，它吸附的污染物很难被彻底清洗，特别是清洁剂。有研究显示了玻璃器皿清洗的难度之大，并最终建议用自来水和去离子水分别各冲洗玻璃器皿10次，以获得满意的洁净效果。 当确定玻璃容器存在污染时，建议分别使用非常热的自来水（热水似乎有利于脱附长链洗涤剂）、纯净水以及有机溶剂来清洗。平时仅用纯水（如果使用的溶液中含有盐）和有机溶剂清洗即可。
当鬼峰是由于流动相中存在污染且无法排除或者规避时，可以在泵和混合器后、进样器之前加入流动相纯化的工具进行在线净化，从而捕集掉这些可能形成鬼峰的污染物。
2. 鬼峰的其他原因
2.1 柱流失
色谱柱固定相在梯度后段（或更强洗脱条件时）的流失（也就是键合相从基质上脱落下来进入流动相）会增加。这种现象在苯基（Phenyl）或者五氟苯基（PFP）等键合的色谱柱上会更常见。图6为PFP柱和C18柱在相同流动相条件下跑的第一针的图谱，整个系统在梯度运行前已经静置了数小时以让柱流失更容易被观察到，可以看到使用五氟苯基柱时在梯度末端会出现一个比较宽的峰。
这种情况会因固定相的柱流失速度和色谱方法的不同而有所不同，很多情况只在第一针时出现，但是也有在整个进样序列中都出现的情况。
2.2 泵和混合系统的问题
在一些梯度方法中，在开始梯度前需要一段时间的等度流动相，以增强某些化合物的保留或者为了达到其他分析目的。分析人员可以选择不同的方法来实现这种梯度变化，不同方法会对梯度造成不一样的影响。比如有方法需要75%甲醇的流动相维持45分钟，然后在一分钟内转换为90%甲醇，然后等度保持14分钟。实现这一目标的两种可能方法是： A：用75%甲醇配制洗脱液a，用90%甲醇配制洗脱液b，将溶剂由100%a变为100%b；B：用100%水配制洗脱液a，用100%甲醇配制洗脱液b，将溶剂由75%b变为90%b。
如果流动相是预混合的，如方法A，将在55分钟处观察到一个鬼峰，如图7所示。这种现象可以在各种不同的仪器上看到，通常在一个序列中所有的进样都会观察到相同的鬼峰（但也有例外）。它有时会表现为一个方形峰，有时会表现为一个或两个峰，因此往往确定这个问题的来源需要花费很多的时间。在本案例中，鬼峰主要归咎于流动相B启动的延迟，在设计方法时维持两相的一直运转比让其中一相在一段时间内停止运转要更合理一些。其他可能导致鬼峰的来自泵系统的原因有阀部件的泄露或者运转不正常、溶解的空气、流动相中某些成分的损失或者增加（如混合过程中的析出或再溶解）等。
2.3 进样带入的空气和流动相的脱气不足
当在进样过程中无意进了空气到系统中时，会出现和真正的分析物峰几乎一样的鬼峰。在许多仪器上，取样后针尖可能会有一小段空气，在存在缺陷的进样器中，这种情况可能会因虹吸效应而加剧。而除非注入非常大体积的空气，否则这种方式注入的空气会在系统的压力下立即被压缩并溶解到流动相中，而这段空气溶解量更大的流动相会像样品中的化合物一样在色谱柱中纵向扩散，而空气溶解量更大的流动相的吸光度会比脱气更充分的流动相有更高的吸收，因此这种流动相峰会看起来非常像真正的化合物的峰。
同样的道理，当样品中溶解了比较多的空气时，也可能出现类似的鬼峰。当样品溶剂和流动相的溶解气体（尤其是氧气）的量有差异时会产生相同特征的空气峰，溶解的空气会有明显的保留，其保留时间一般是t0的2到3倍，这使得确认峰的来源变得比较困难。当怀疑是这个原因导致鬼峰时，可以通过进样刚经过脱气的样品来观察峰的大小来确定。
有时会遇到的另一个问题是不寻常的“鲨鱼鳍”形峰，如图8红色圈出的部分峰所示。峰值的大小取决于情况的严重程度，可以比较小（1-10 mAU）或比较大（到1 AU）。上面的图中就有几个“鲨鱼鳍”形峰，这是由于在线脱气模块效率太低造成的，而使用经过氦气脱气的流动相跑出来的图就没有这些峰（下面的图）。这些峰是由于液相体系发生压力瞬间降低导致的，我们知道空气在纯水和纯有机溶剂中的溶解度通常比在两者的混合物中的溶解度大，因此当空气溶解量较高的溶剂混合时，由于溶解度降低而并发生脱气现象。在低压混合系统中（即溶剂混合发生在泵前），这可能会导致气泡出现在泵内，从而导致压力降低和吸光度的变化，随后压力平稳回升，出现线性的拖尾。在特别严重的情况下，气泡可能导致泵不能正常运转（这种在高压混合系统中通常观察不到，因为溶剂在进入泵之前没有混合）。在“鲨鱼鳍”形峰后，空气可能会以前面所述的相同机制形成空气峰。为了减少流动相在流经色谱柱后出现脱气而被检测到，有一种简单的操作是在检测器后的废液管路上增加30-40 cm的peek管， 这可以增加了一些压力从而降低脱气发生的可能性。
一般来说大部分的HPLC的在线脱气效率是足够的，但也有一些仪器可能在这方面存在缺陷，如果脱气效率不够高，使用氦气来驱逐溶剂中的空气是一种不错的辅助方法，但我们也应该了解当氦气停止时，溶剂又开始溶解空气了，而且如果氦气的喷射口不够干净或者氦气管路中存在挥发性杂质时可能又会引入新的鬼峰。
2.4 进样残留
如果样品中含有强保留的组分时，而一个梯度方法周期内无法将其完全洗脱下来时，那么这些组分可能在随后的进样中被洗脱下来而成为鬼峰。为了避免这个问题，我们必须努力确保梯度系统运行到足够的溶剂强度，以洗脱所有样品组分在一次运行周期内被充分洗脱下来。当怀疑是这种情况时，可以通过增强梯度终点中的有机相的比例或者延长梯度终点的等度保持时间来观察是否有其他峰被洗脱出来即可。 下图为星谱实验室在分析某中药制剂样品时发现在原方法周期（65 min）内会有成分无法洗脱出来，当在原梯度方法后增加洗脱强度后可以看到明显的额外的峰（红色虚线框出来的部分）。这种残留不仅会导致后续进样中出现鬼峰，还可能会累积在色谱柱上导致色谱柱性能的下降（如柱效降低、峰形异常等）。
2.5 样品的污染
与空气峰一样，样品污染可能会在等度和梯度HPLC中引起鬼峰。有人发现在用聚四氟乙烯-橡胶隔垫的进样小瓶在第二次和以后注射中观察到鬼峰，而使用更惰性的聚四氟乙烯-硅胶-聚四氟乙烯隔垫的进样小瓶时观察到的鬼峰较少。第一次注射时聚四氟乙烯膜的破裂使小瓶内的样品溶液与隔垫中的橡胶接触从而使其中的某些成分进入到样品溶剂中导致鬼峰。他们也发现用于工厂清洁验证的拭子样本被工厂操作人员使用的胶乳橡胶手套污染从而导致鬼峰（最终为了避免这种情况，清洁验证中只能规定使用的手套的类型）。
2.6 流动相成分与固定相的作用
当流动相中的成分在色谱柱固定相发生吸附或者置换时，就可能在色谱图上观察到鬼峰或者空白峰，这种峰的出峰时间一般非常靠前，在使用TFA或者一些离子对试剂时出现的概率会更大一些。
全文总结
本文在文献和星谱实验室的部分数据的基础上总结了鬼峰的各种来源及其形成机理，这些鬼峰主要在梯度方法中出现，虽然不可能面面俱到，但是可以为我们遇到类似问题时的排查提供了一些方向。对于一线的分析工作者，最重要的是了解这些鬼峰的来源后在具体的实验操作中从源头上避免鬼峰的出现，当遇到一些自己无法掌控的情况，如用到的试剂含有某些杂质时，可以使用一些工具（如鬼峰捕集小柱）对鬼峰进行消除。
最后，祝项目顺利！
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